PeakTrace

サンガー法によるDNAシーケンシス・トレースの読み取り品質と配列長を改善するために新しく開発されたベースコーラ―およびトレース・プロセッサ

製品概要

PeakTraceは、サンガー法によるDNAシーケンスの読み取りの品質と塩基配列長を改善するために新たに開発されたベースコーラー(Basecaller)およびトレース・プロセッサです。また、ABI310,3700,3130,3730,3500を含む、ABI社の全機器から得られたシークエンス・データに対応します。PeakTraceはABI KB Basecallerと比較して高品質な塩基数が50%も飛躍したほか、現在流通しているどんなベースコーラーよりも波形の改善がなされており、かつエラー率も低減されています。

PeakTraceはKBやTraceTunerやphred等の従来のサンガー法によるDNAシーケンシス解析用のBasecallerよりも、質の高いBasecallingを提供します。PeakTraceは、グラフィカル・ユーザー・インターフェイスで使用できるほか、コマンドライン・バージョンで既存LIMSインフラに組み合わせることも、またエンドユーザーが「Chromas for PeakTrace」で使用することも可能です。ユーザーは、アウトプット・ファイル・フォーマットやトレース・エンハンスメント、トリミング・セッティングといった様々なbasecallingやトレース・プロセッシングのパラメータを、完全にコントロールすることができます。

PeakTraceは、ABI、SCF両方の拡張子でトレース・ファイルを作成できるほか、SEQ(FASTAあるいはABI)やQUAL,PHD.1,QualTRACE Ⅲ TraceReportのように様々なテキスト・ファイルも作成することができます。

開発元:オーストラリア Nucleics Pty Ltd

 

技術情報

 

バリデーション

 

目的

現在の改良されたBasecallersを用いると、簡単な方法で読み取る配列の長さを拡大することができます。しかしながら、新しいBasecallersを商品として販売する前には、そのBasecallersの予測される品質スコアと実際に得られる品質スコアが一致しているかバリデーションする必要があります。このバリデーション(品質スコアマッピングとして知られる)により、その新しいBasecallerから出力されたデータは正確であり、発生する問題はBasecallersのプログラム設定によるものではないことを保証します。

Peak Traceを用いると、簡単に読み取る配列の長さを伸ばすことができます。ここでは、ABI社のKBとPeak Traceを用いバリデーション(品質スコアマッピングを用いて)を行うことで、Peak Traceで出力されたデータが正確であることを示します。

 

方法

本研究では、2つの175kBの鮭のBACクローン由来のpUCサブクローンより回収した2203塩基配列を用いて、ABI社のKBvl.2とNucleics社のPeakTraceを比較しました。

最初に間違った塩基配列や混合した配列を除去するために、Nucleics社のQualTraceQCを用いて、その2203塩基配列のデータを解析しました。

続いて、確実に類似した塩基配列を比較できるように、PeakTraceとKBの両ソフトウェアで読み取れる配列を含むようにして解析を行いました(その配列にはPeakTraceで解析すると10個以上のQ20 +塩基が付加されます)。

次は、BLAST(NCBI)を用いて、それぞれのBACクローンのコンセンサス配列と解析した塩基配列を並べて比較しました。BACクローンの塩基配列を並べて比較しました。BACクローンの塩基配列と一致しなかった塩基配列についてはこれ以上解析ができないので排除しました(一致しなかった配列のほとんどは大腸菌K12のゲノムDNAの汚染によるものでした)。

以上の4つのスクリーニング基準を満たした塩基配列数は合計1643でした。そして、BLASTにより並べたその塩基配列を用いて、EwingとGreenの研究内容(参考文献1)を参考に、前1643塩基配列数または観測されたエラーを計算しました。つまり、各アライン塩基に対して、正確・不正確なBasecallの合計を記録するようにしました(観測された品質スコアあるいはQ)。アライン塩基の合計および各Basecaller品質スコア予測の精度も測定するため、それらを各Basecallerの予測されるエラー率(予測Qスコア)と比較しました(Qスコアマッピングとして実行)。

 

 

図1. KBとPeakTrace(PT)ベースコーラ―の比較結果(同一トレースファイル使用)

 

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図2. KBベースコーラ―によるBLASTアライメント; 1%エラーリード(解読)長:1275塩基

 

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図3. PeatTraceベースコーラ―によるBLASTアライメント; 1%エラーリード(解読)長:1486塩基

 

結果

Qスコアマッピングの結果を図4に示しました。結果は、KBよりPeakTraceのほうが正確に実際のエラー率を予測するということが分かりました。特にこの精度の向上は、KBで予測されていた塩基配列の品質を大きく上回るQ20からQ30までの中間品質スコアで非常に顕著です。

 

表1. KBとPeakTraceベースコーラ―のBLASTアライメント比較結果(図2,3)

KB PeakTrace
アライメントされた解読塩基数 1379 1540
最初のエラーがある解読塩基 1084 1251
1%エラー解読塩基数 1275 1486

 

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図4. KBとPeakTraceの予測品質の比較(Observed vs Predicted)

 

KB PeakTrace
Q20+塩基数 796 955
アラインされた塩基数 868 1031

 

表2. KBとPeakTraceで解析し、BLASTを用いてアラインした平均塩基配列数

 

結論

PeakTraceで読み取る塩基配列の長さは19%増加し、Q20+の塩基配列については20%の増加が見られました(表2)。本研究での各Basecallerのデータ集積は、塩基配列1000番目から1050番目までの塩基配列間でKBの最適化による解析が停止したので、PeakTraceを使用する際は、既定の実行モジュール時間を2~3分延長してからデータを収集することをお勧めします(すなわち塩基配列1200番目から1300番目の間に解析を中止するということです)。このようなセッティングで解析される結果を見ると、PeakTraceのパフォーマンスがKBと比べ大いに向上していることが分かります。

 

参考文献

1.Ewing B. & Green P.(1998). Base-calling of automated sequencer traces using phred.Ⅱ.Error probabilities. Genome Res.8(3):186-194

 

更新履歴/バージョン情報

 

PeakTrace 6.951(2020年9月9日リリース)

  • a minor bug fix release

 

PeakTrace 6.95(2020年9月1日リリース)

  • New Feature. Keep bubble spikes in the processed trace using the -ks option.
  • New Feature. Auto PeakTrace 6 will check if you wish to save changes when exiting options window without manually saving.
  • Improved mixed basecalling.
  • Improved crosstalk correction on rare trace types.
  • Improved processing and basecalling of traces with bubble spikes.
  • Improved early basecalling.
  • Bug fixes.

 

PeakTrace 6.94 (2019年12月21日リリース)

  • New feature. ABI377 and ABI310 .ab1 files are now output in .ab1 format with quality scores.
  • New feature. Trace files without basecall or processed trace data can be output in .ab1 format using force processing setting.
  • New feature. Support added for the following run conditions and instruments:
    • ABI310
      • 30cm POP4 BigDye 3 & 1
      • 30cm POP6 BigDye 3 & 1
      • 36cm POP4 BigDye 1
      • 50cm POP6 BigDye 3 & 1 Rapid Run
    • ABI3700
      • POP6 BigDye 3 & 1
      • POP5 BigDye 3 o ABI3130/3730
      • 50cm POP7 ET terminator
      • 50cm POP6 ET terminator
    • ABI3130
      • 80cm POP4 BigDye 3 & 1
    • ABI3200
      • 9kV BigDye 1
      • 4kV BigDye 1
    • MJResearch Biostation
  • Default value for q average trim changed to 9 in a window of 40 bases.
  • Default value for good base improvement changed to -10.
  • Error code 25 description changed from “normalization failed” to “overload trace” to make cause of this result clearer.
  • Improved mixed basecalling.
  • Improved basecalling through “Dye Blob” regions.
  • Improved processing of PCR product traces.
  • Bug fixes.

 

PeakTrace 6.936 (2019年9月4日リリース)

  • a minor release that squashes a few bugs that have been uncovered over the last couple of months.

 

PeakTrace 6.935 (2019年7月17日リリース)

  • a minor release that improves the basecalling why large or late air bubble spikes are present in the raw data. 

 

PeakTrace 6.934 (2019年6月13日リリース)

  • a small bug fix release that corrects an issue with the simple mixed basecall as well as a rare thread race issue when archive traces and auto start are both selected. Unless you are using simple mixed basecall (nobody should be as it is inferior to standard mixed basecalling), this update is optional.

 

PeakTrace 6.92 (2018年11月23日リリース)

  • a bug fix and enhancement release

 

PeakTrace 6.91(2018年5月22日リリース)

  • minor bug fixes.

 

PeakTrace RP 6.91(2018年5月21日リリース)

  • New Feature. x64 version.
  • New Feature. High DPI monitor support.
  • New PeakTrace installer.
  • Further improvements to the processing and basecalling of weak traces.
  • 7za updated to 18.05.
  • cURL updated to version 7.59.0.
  • Wine updated to 2.2 for the MacOSX release.
  • Other minor bug fixes and enhancements.

 

PeakTrace 6.90(2018年5月3日リリース)

  • New Feature. Support for ThermoFisher SeqStudio™ Sequencer.
  • New Feature. Fuse trace at base default is now 0.
  • Improved basecalling especially of low quality traces.
  • Improved trace processing.
  • Improved peak normalization.
  • Improved clean baseline.
  • Improved detection of PCR products.
  • Improved PeakTrace processing and basecalling through “dye blobs” peaks.
  • The signal start peak auto setting now sets the start peak to the value closest to the model expected value.
  • The automatic fuse trace at base or fuse basecalling at base on traces with large dye blobs peaks can be turned off by setting fuse basecall to -1.
  • Unit data and build date can be written to a text file with the -rf options.
  • Support temporary removed for the following machines and run types. These run conditions are rarely used, but support will be returned in the next major update.
    • ABI3700 runs
    • MegaBACE 1000 & 4000 runs
    • ABI 3130 80cm array runs
    • ABI 3730 runs below 6kV
    • The following ABI 310 runs
      • 36cm array runs
      • 50cm array runs
      • 30cm array runs with a voltage below 12 kV
    • All ET terminator runs
    • MJ Research Biostation runs
  • Update of the CodeMeter runtime to 6.60a. Due to limitations of the CodeMeter runtime support on Linux this update is only compatible with REHL7/CentOS7.
  • Many other bug fixes and internal improvements.

 

PeakTrace RP 6.9(2018年5月1日リリース)

  • New Feature. Support for the ThermoFisher SeqStudio™ Sequencer.
  • New Feature. Fuse trace at base default now 0.
  • Improved basecalling especially of low quality traces.
  • Improved trace processing.
  • Improved peak normalization.
  • Improved clean baseline.
  • Improved detection and basecalling of PCR product traces.
  • Improved PeakTrace processing and basecalling through “dye blobs” peaks.
  • The signal start peak auto now sets the start peak to the value closest to the model expected value.
  • The automatic fuse trace at base or fuse basecalling at base on traces with large dye blobs peaks can be turned off by setting fuse basecall to -1.
  • An additional secondary PeakTrace RP server established in China.
  • Unit data and build date can be written to a text file with the -rf options.
  • Support temporary removed for the following machines and run types. These run conditions are rarely used, but support will be returned in the next major update.
    • ABI 3700 runs
    • MegaBACE 1000 & 4000 runs
    • ABI 3130 80cm array runs
    • ABI 3730 runs below 6kV
    • ABI 310 36cm & 50cm array runs
    • ABI 310 30cm array runs with a voltage below 12 kV
    • All ET terminator runs
    • MJ Research Biostation runs
  • Bug fix that prevented clear range trim from being applied to the front of the trace.
  • Many other bug fixes and internal improvements.

 

動作環境

PeakTrace 6.951 RP 最小構成 (2020年9月15日現在)

  • Windows XP, Windows Vista, Windows 7, Windows 8, Windows 10(*1), または MacOS X 10.6+.
  • インターネット接続環境
  • RAM 1GB
  • 10GB 空きディスク容量
  • 1024×768 以上の画面解像度

 

PeakTrace:Box 6.951 最小構成 (2020年9月15日現在)

  • Windows XP, Windows Vista, Windows 7, Windows 8, Windows 10(*2)
  • SSE3をサポートするIntel Core CPU. ※CPU性能が律速になるため、最新のCPU使用を推奨します
  • RAM 2 GB
  • 25 GB 空きディスク容量
  • 1024×768 以上の画面解像度.
  • PeakTrace USB Key with a valid license and firmware 2.04 以降
  • CodeMeter Runtime 6.70a 以降
  • 専用ライセンス(*3)
  • 専用シリアルナンバー(*4)

※仮想化環境(VMware, Xen等)では動作しませんのでご注意ください。

 

(*1)Windows Server 2003, 2008, 2012でもおそらく動作しますが、十分なテストは行っておりません。

(*2)Windows Server 2003, 2008 は正式サポートOSではありませんが、ご希望があればお問合せください。

(*3)PeakTrace 5.92 以前のバージョンをお使いの場合は、開発元 Nucleics Pty Ltd あるいは弊社営業担当までお問合せください。

(*4)PeakTrace 6.11 以前のバージョンをお使いの場合は、開発元 Nucleics Pty Ltd あるいは弊社営業担当までお問合せください。

 

評価ライセンス

無償評価ライセンスをご提供可能です。

ご希望の場合、こちらのフォームから申請いただくか、営業担当までお問い合わせください。

 

ライセンス形態

 

ラインナップ

PeakTrace RP
小~中規模の施設向けのPeakTraceで、ユーザー・インストール・バージョンです。データ処理はNucleics社PeakTraceサーバーで行われます。
PeakTrace : Box
中~大規模の施設向けに設計された、独立型のハードウェアシステムです。高度なデータセキュリティでもオフラインで稼働できるシステムです。PeakTrace:Box 1ライセンスに付き、1つのUSBライセンスキーが付属します。
PeakTrace for Chromas
トレースビューアとベースコーラーが組み合わされた、小規模施設またはエンドユーザー向けに設計されたものです。PeakTraceの簡易利用バージョンです。

 

ライセンス料

商品名 価格(税抜)
PeakTrace RP 100 units ¥4,000
PeakTrace RP 1000 units ¥28,000
PeakTrace RP 2000 units ¥47,000
PeakTrace RP 5000 units ¥95,000
PeakTrace RP 10000 units ¥152,000
PeakTrace RP 20000 units ¥253,000
PeakTrace RP 50000 units ¥505,000
PeakTrace: BOX 10000 units and 1 year using ¥320,000
PeakTrace: BOX 20000 units and 1 year using お問合せください
PeakTrace: BOX 30000 units and 1 year using お問合せください
PeakTrace: BOX 50000 units and 1 year using お問合せください
PeakTrace: BOX 100000 units and 1 year using お問合せください
PeakTrace: BOX 10000 units and 1 year using With QualTrace ¥350,000
PeakTrace: BOX 20000 units and 1 year using With QualTrace お問合せください
PeakTrace: BOX 30000 units and 1 year using With QualTrace お問合せください
PeakTrace: BOX 50000 units and 1 year using With QualTrace お問合せください
PeakTrace: BOX 100000 units and 1 year using With QualTrace お問合せください

 

※上記価格は予告なく変更される場合があります。

 

FAQ

FAQはこちら

公開日:2020/01/26
最終更新日:2020/09/15